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        组织蛋白酶V(CTSV)酶联免疫吸附测定试剂盒
        发布时间:2021-10-26   点击次数:337次

        检测原理

        试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被组织蛋白酶V(CTSV)抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的组织蛋白酶V(CTSV)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。

        样品收集、处理及保存方法

        1.  血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

        2.  血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

        3.  细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

        4.  组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

        5.  保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

        自备物品

        1. 酶标仪(450nm)

        2. 高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

        3. 37℃恒温箱

        操作注意事项

        1.  试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

        2.  实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。

        3.  浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白;按照说明书操作时样本已经稀释5倍,最终结果乘以5才是样本实际浓度

        4.  严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

        5.  所有液体组分使用前充分摇匀。

        试剂盒组成

        名称

        96孔配置

        48孔配置

        备注

        微孔酶标板

        12孔×8条

        12孔×4条

        标准品

        0.3mL*6管

        0.3mL*6管

        样本稀释液

        6mL

        3mL

        检测抗体-HRP

        10mL

        5mL

        20×洗涤缓冲液

        25mL

        15mL

        按说明书进行稀释

        底物A

        6mL

        3mL

        底物B

        6mL

        3mL

        终止液

        6mL

        3mL

        封板膜

        2张

        2张

        说明书

        1份

        1份

        自封袋

        1个

        1个

        注:标准品(S0-S5)浓度依次为:0、5、10、20、40、80 pg/mL

        试剂的准备

         20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

        洗板方法

        1.  手工洗板:甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置1min后甩尽孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板5次。

        2.  自动洗板机:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。

        操作步骤

        1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。

        2.  设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;

        3.  样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。

        4.  除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

        5.  弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

        6.  每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

        7.  每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

        结果判断

         绘制标准曲线:在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。


        试剂盒性能

        1.  准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.9900。

        2.  灵敏度:检测浓度小于1.0 pg/mL

        3.  特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

        4.  重复性:板内、板间变异系数均小于15%。

        5.  贮藏:2-8℃,避光防潮保存。

        6.  有效期:6个月

        免责声明

        1.   试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验或体实验,否则所产生的一切后果,由实验者承担,本公司概不负责。

          严格按照说明书操作,实验者违反说明书操作,后果由实验者承担。


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